1. Введение
В ходе фармацевтического производства нескольких лекарственных препаратов на совмещённой линии при смене производимого препарата производится очистка промышленного оборудования от следов предыдущего препарата. В ходе очистки проводится определение остаточных количеств фармацевтической субстанции на поверхности оборудования и в смывах с него. Метод определения субстанции должен быть максимально простым, поэтому предпочтительным методом анализа является абсорбционная спектрофотометрия.
Препараты на основе адамантана применяются для профилактики и лечения некоторых штаммов вируса гриппа, а также для лечения болезни Паркинсона. В группу производных адамантана входят адапален, адапромин, амантадин, бромантан, мемантин, римантадин, саксаглиптин, тромантадин и вилдаглиптин, из которых наибольшее применение находят амантадин, мемантин и римантадин.
Производные адамантана не обладают собственным светопоглощением в области длин волн абсорбционной спектрофотометрии, однако предложено
множество методов спектрофотометрического определения этих фармацевтических субстанций, основанных на образовании окрашенных комплексов с различными реагентами. Эти реагенты перечислены в таблице 1.
Обзор реагентов для спектрофотометрического определения амантадина, мемантина и римантадина
| Анализируемые фармацевтические субстанции | Хромогенные реагенты | Ссылка |
| Мемантин | Реагент Фолина-Чокальтеу, 1,2-нафтохинон-4-сульфонат | [1] |
| Мемантин | ‐фтальальдегид + N‐ацетил‐L‐цистеин | [2] |
| Амантадин | o | [3] |
| Амантадин | Хлорид железа (III) | [4] |
| Амантадин | Перманганат калия | [5] |
| Амантадин | Молибдат аммония, йод, ацетальдегид + хлоранил | [6] |
| Амантадин | Сульфат церия (IV)-аммония, перманганат калия, метаванадат аммония, оксид хрома (VI), бихромат калия | [7] |
| Мемантин | Сульфат церия (IV) | [8] |
| Амантадин | β-циклодекстрина и теллурида кадмия | [9] |
| Амантадин, мемантин, римантадин | β-циклодекстрин | [10] |
| Мемантин | Эозин Y | [11] |
| Римантадин | Бромтимоловый синий | [12] |
| Амантадин | Бромкрезоловый зелёный, бромфеноловый синий, бромтимоловый синий | [13] |
| Мемантин | Бромкрезоловый зелёный, бромтимоловый синий | [14] |
| Мемантин | Бромфеноловый синий, бромкрезоловый пурпурный, метиловый оранжевый | [15] |
| Мемантин | Бромтимоловый синий, Солохром чёрный Т | [16] |
| Амантадин, мемантин, римантадин | Бромфеноловый синий | [17] |
| Мемантин | 2,2-дигидроксииндан-1,3-дион | [18] |
| Мемантин | 2,2-дигидроксииндан-1,3-дион, хлорид железа (III), ванилин | [19] |
| Амантадин, мемантин, римантадин | 1,3-индандион | [20] |
| Амантадин | Йод | [21] |
| Мемантин | Йод | [22] |
| Амантадин | Метиловый оранжевый | [23] |
| Мемантин, римантадин | 1,2-нафтохинон-4-сульфонат | [24] |
| Мемантин | Бромкрезоловый зелёный, 2,4,6-тринитрофенол | [25] |
| Амантадин | Тетрацианоэтилен | [26] |
| Амантадин | 1,2-нафтохинон-4-сульфонат | [27] |
| Амантадин | 1,2-нафтохинон-4-сульфонат | [28] |
| Амантадин | Гидроксид натрия | [29] |
| Мемантин | -хлораниловая кислота, 7,7,8,8-тетрацианохинодиметан | [30] |
| Мемантин | Нет | [31] |
| Мемантин | 1-хлор-2,4-динитробензол | [32] |
| Мемантин | Бенгальский розовый | [33] |
| Мемантин | N,N-диметиланилин | [34] |
Из перечисленных в таблице 1 реагентов 1,2-нафтохинон-4-сульфонат
[1][24][27][28]4-хлор-7-нитробензо-2-окса-1,3-диазол, o‐фтальальдегид и N‐ацетил‐L‐цистеин [2], хлоранил [6], β-циклодекстрин [9], [10], эозин Y [11], Солохром чёрный Т [16], 2,2-дигидроксииндан-1,3-дион [18], [19], ванилин [19], 1,3-индандион [20], [25][26]хинализарин, п-хлораниловая кислота, 7,7,8,8-тетрацианохинодиметан[30]1-хлор-2,4-динитробензол[32][33]N,N-диметиланилин [34]
Методы анализа, основанные на реакциях окисления амантадина солями железа (III)
[3][4][19][8][7][1][6][5][21][22][14][25][13][15][17][12][16][23]
Реакция амантадина с гидроксидом натрия
[29][31][35][36][37][38][39][40]
1-фтор-2,4-динитробензол широко используется в фармацевтических лабораториях для анализа аминокислот и белков. Кроме того, он вступает в реакцию с первичными аминогруппами, в том числе, расположенными на концах крупных молекул, что позволяет использовать его для их спектрофотометрического определения. Определение возможно в смесях воды с ацетонитрилом
[41][42]
2. Экспериментальная часть
1-фтор-2,4-динитробензол (98%, CAS 70-34-8, Sigma-Aldrich, США), гидрокарбонат натрия (ЧДА, ГОСТ 4201-79, ООО "Ленреактив", Россия), гидроксид натрия (ЧДА, ГОСТ 4328-77, ООО "Компания Пущинские лаборатории", Россия), 1,4-диоксан (ЧДА, ГОСТ 10455-80, АО "Экос-1", Россия), этанол (96%, ГОСТ 18300-72, АО "Экос-1", Россия),
Для взвешивания использовались аналитические весы Sartorius Cubis MSA 225P-ICE-DI (Sartorius AG, Германия). Деионизованная вода получена с использованием системы очистки воды Sartorius Arium Pro VF Ultrapure Water (Sartorius AG, Германия). Для нагрева образцов использовалась водяная баня Stegler WB-4 (ИП Дубин М. Е., Россия). Отбор аликвот осуществлялся с использованием автоматических пипеток производства Thermo Fisher Scientific, США. Экстракция проводилась в мерных пробирках со шлифом ПМ-2-20-14/23 (ГОСТ 1770-74, ИП Василец Д. Н., Россия). Спектрофотометрические измерения проводились в кварцевых кюветах с длиной светового пути 1 см при помощи спектрофотометра UV-7 (Mettler-Toledo International Inc., США). Используемая стеклянная и фарфоровая лабораторная посуда соответствовала ГОСТ 29228-91, ГОСТ 23932-74, ГОСТ 20292-74, ГОСТ 9147-80. Для фильтрования суспензий использовались бумажные фильтры с диаметром пор 12 мкм в соответствии с ГОСТ 12026-76. Медицинская вата соответствовала ГОСТ 5556-81. Стальные пластины, изготовленные из стали Ст3 в соответствии с ГОСТ 19903-74, приобретены у ООО "Веста М", Россия.
Для приготовления 0,1 М раствора гидрокарбоната натрия навеска 0,21 г NaHCO3Missing Mark : sub растворяется в 25,0 мл воды. Для приготовления 0,2 М раствора гидроксида натрия сначала смешивается 9,0 мл воды и 6,0 мл 1,4-диоксана, затем навеска 0,08 г NaOH растворяется в 10,0 мл приготовленной смеси воды и 1,4-диоксана. Для приготовления раствора 1-фтор-2,4-динитробензола концентрации 1,2% навеска 0,12 г C6Missing Mark : subH3Missing Mark : subFN2Missing Mark : subO4Missing Mark : sub растворяется в 10,0 мл 96% этанола. Для приготовления основного раствора гидрохлорида мемантина или гидрохлорида римантадина концентрации 500
в которой
— заявленная производителем чистота фармацевтической субстанции; взятая навеска растворяется в 100 мл воды. Из приготовленных основных растворов мемантина или римантадина готовится ряд градуировочных растворов меньших концентраций.
Одна таблетка гидрохлорида мемантина содержит 10 мг фармацевтической субстанции. Содержимое 20 таблеток тщательно растирается в фарфоровой ступке, переносится в химический стакан и суспензируется в 200 мл воды, суспензия фильтруется через бумажный фильтр, фильтрат собирается в мерную колбу объёмом 1 л, и раствор доводится до метки водой. Концентрация мемантина в приготовленном растворе составляет 200
Одна таблетка гидрохлорида римантадина содержит 50 мг фармацевтической субстанции. Содержимое 20 таблеток тщательно растирается в фарфоровой ступке, переносится в химический стакан и суспензируется в 200 мл воды, суспензия фильтруется через бумажный фильтр, фильтрат собирается в мерную колбу объёмом 1 л, и раствор доводится до метки водой. Из полученного раствор отбирается аликвота 10 мл, переносится в мерную колбу объёмом 50 мл, и раствор доводится до метки водой. Концентрация мемантина в приготовленном растворе составляет 200
Аликвота 10 мл приготовленного рабочего раствора из субстанции или из таблеток мемантина или римантадина концентрации 200
Процедура адаптирована из работы
[42]
Пробирки с растворами извлекаются из водяной бани, остужаются до комнатной температуры, их содержимое переносится в мерные колбы вместимостью 10,0 мл и объёмы растворов в колбах доводятся до метки водой. Содержимое колб переносится в пробирки вместимостью 20 мл с притёртыми пробками, каждую пробирку по 5,0 мл
3. Результаты и обсуждение
Аминогруппа мемантина или римантадина в слабощелочной среде вступает в реакцию нуклеофильного замещения с атомом фтора в молекуле 1-фтор-2,4-динитробензола:
Непрореагировавший 1-фтор-2,4-динитробензол затем гидролизуется до 2,4-динитрофенола в сильнощелочной среде:
Продукт реакции C12Missing Mark : subH19Missing Mark : subNHC6Missing Mark : subH3Missing Mark : sub(NO2Missing Mark : sub)2Missing Mark : sub затем экстрагируется в органический растворитель, полученный экстракт поглощает ультрафиолетовое излучение, максимум поглощения наблюдается при длинах волн 335
–[42]
Абсорбционный спектр продукта реакции показан на рисунке 1.
Абсорбционный спектр C12H19NHC6H3(NO2)2 в н-декане после экстракции
Для выбора наилучшего экстрагента анализ мемантина и римантадина проведён с использованием в качестве органических экстрагентов различных растворителей:
Зависимость коэффициента молярного погашения производных мемантина и римантадина от органического экстрагента
—
Аналитические показатели метода определены в соответствии с ОФС.1.1.0012.15 Государственной фармакопеи Российской Федерации. Метод проверен на линейность, избирательность, правильность и повторяемость в пределах одного и нескольких дней.
Согласно Государственному реестру лекарственных средств, основными вспомогательными компонентами в таблетках мемантина и римантадина являются моногидрат лактозы, микрокристаллическая целлюлоза, кроскармеллоза натрия, повидон К25, коллоидный диоксид кремния, стеарат магния, дигидрофосфат кальция, тальк и крахмал. Большинство из этих веществ нерастворимы в воде, и отделяются от основного компонента предварительной фильтрацией. Лактоза не содержит в своём составе аминогрупп, поэтому не взаимодействует с 1-фтор-2,4-динитробензолом. Таким образом, присутствующие в таблетках вспомогательные вещества не оказывают на ход анализа мешающего влияния.
По данным эксперимента, линейная зависимость абсорбируемости продукта реакции в органическом растворителе от концентрации мемантина или римантадина соблюдается в интервале концентраций от 40 до 500
2,8 мМ— экстракция продукта в органический растворитель перестаёт быть количественной, что приводит к появлению отклонений от закона Бера. Регрессионный анализ зависимостей абсорбируемости от концентраций мемантина и римантадина выполнен при помощи метода наименьших квадратов, и предел обнаружения и предел количественного определения вычислены в соответствии с по формулам:
в которых
— ОФС.1.1.0013.15, b — угловой коэффициент уравнения линейной регрессии. Результаты расчётов представлены в таблице 3.
Линейность, предел обнаружения и предел количественного определения метода
Выполнен анализ десяти растворов, приготовленных из фармацевтической субстанции, десяти растворов из таблеток, а также модельных смывов с промышленного оборудования. Во всех случаях концентрация мемантина и римантадина составляла 200
в которой
— концентрация раствора, [LATEX_FORMULA]^{мг}/_{л}[/LATEX_FORMULA], [LATEX_FORMULA]\overline{c_\text{e}}[/LATEX_FORMULA]— среднее значение экспериментально определённых концентраций раствора из десяти параллельных определений, [LATEX_FORMULA]^{мг}/_{л}[/LATEX_FORMULA].
Для оценки повторяемости указанный выше анализ выполнен в течение пяти последовательных дней. Для оценки повторяемости вычислены значения относительно стандартного отклонения результатов по формуле:
в которой
— экспериментальное значение концентрации раствора, [LATEX_FORMULA]^{мг}/_{л}[/LATEX_FORMULA], [LATEX_FORMULA]\overline{c}[/LATEX_FORMULA] — среднее значение экспериментальных значений концентрации из всех параллельных определений, n — число параллельных определений (равное 10 для оценки повторяемости в пределах одного дня и 5 для оценки повторяемости в пределах нескольких дней). Результаты расчёта представлены в таблице 4.
Правильность и повторяемость метода
| | Мемантин | Римантадин |
| Относительная погрешность для растворов из чистой субстанции, % | 3,3 | 2,9 |
| Относительное стандартное отклонение для растворов из чистой субстанции в пределах одного дня, % | 3,4 | 3,1 |
| Относительное стандартное отклонение для растворов из чистой субстанции в пределах нескольких дней, % | 3,9 | 3,6 |
| Относительная погрешность для растворов из таблеток, % | 4,1 | 4,0 |
| Относительное стандартное отклонение для растворов из таблеток в пределах одного дня, % | 4,4 | 3,8 |
| Относительное стандартное отклонение для растворов из таблеток в пределах нескольких дней, % | 4,9 | 5,2 |
| Относительная погрешность для модельных смывов из чистой субстанции, % | 8,6 | 9,3 |
| Относительное стандартное отклонение для модельных смывов из чистой субстанции в пределах одного дня, % | 9,7 | 10,2 |
| Относительное стандартное отклонение для модельных смывов из чистой субстанции в пределах нескольких дней, % | 9,0 | 9,8 |
| Относительная погрешность для модельных смывов из таблеток, % | 11,4 | 12,3 |
| Относительное стандартное отклонение для модельных смывов из таблеток в пределах одного дня, % | 12,8 | 12,0 |
| Относительное стандартное отклонение для рмодельных смывов из таблеток в пределах нескольких дней, % | 13,6 | 12,9 |
4. Заключение
Основным преимуществом предложенного метода является использование простых реагентов, доступных в любой химико-аналитической лаборатории фармацевтического предприятия. Интервал линейности метода довольно широк и позволяет определять микрограммовые количества мемантина и римантадина в водных растворах. Относительная погрешность и относительное стандартное отклонение определяемых величин концентраций при анализе модельных смывов с оборудования не превышает 15%, что является допустимым в для такого анализа.