1. Введение
Хитозан (Рис. 1) — линейный аминополисахарид, является биосовместимым и биоразлагаемым природным полимером, который состоит из N-ацетил-D-глюкозамина и D-глюкозаминовых звеньев
[1][2]
Структурные звенья полимерных цепей хитина/хитозана
Процесс получения хитозана из хитина реакцией деацетилирования
[3][4][5][6][7]
Образование поликатиона
Цель работы — систематизация современных методов физико-химической характеризации хитозана и анализ их возможностей, ограничений и областей применения.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
1. Проанализировать структурные особенности хитозана, определяющие его физико-химические свойства.
2.
Рассмотреть влияние степени деацетилирования (СД) и молекулярной массы (ММ) на свойства и поведение хитозана
3. Систематизировать современные физико-химические методы анализа хитозана, используемые для определения его структурных характеристик.
4. Сравнить основные аналитические методы по информативности, ограничениям и областям применения.
2. Параметры, определяющие свойства хитозана
Свойства хитозана определяются совокупностью химических, молекулярных и надмолекулярных характеристик
[8][9][10]
Хитозан является линейным аминополисахаридом, представляющим собой сополимер N-ацетил-D-глюкозамина и D-глюкозамина, соединенных
[11][12]
1. Степень деацетилирования
являясь наиболее точным [13][14][12]
2. Первичные аминогруппы хитозана имеют константу ионной диссоциации pKa в интервале 6,3–6,5
[15][10]
3. Наличие свободной аминогруппы делает хитозан гораздо более реакционноспособным по сравнению с хитином или целлюлозой, позволяя проводить селективную химическую модификацию
[7]
Молекулярная масса хитозана варьирует в чрезвычайно широком диапазоне — от олигомеров (<16 кДа) до высокомолекулярных образцов (до 2000 кДа)
[9][16]
1. ММ является определяющим фактором для вязкости растворов
[7]
2. В научной среде существует неопределенность границ категорий ММ — один производитель может называть образец «низкомолекулярным», а другой — «среднемолекулярным», что затрудняет сравнение результатов исследований
[9]
Свойства конечного продукта предопределяются происхождением исходного хитина (панцири ракообразных, кутикула насекомых, клеточные стенки грибов или моллюски)
[9]
1. Исходное сырье содержит хитин в различных формах:
[9][12][17]
2. Традиционный щелочной гидролиз (NaOН 40–60%, температура 110–140°C) неизбежно ведет к частичной деполимеризации — разрыву гликозидных связей и падению ММ
[9][18][12][19]
Хитозан — это полукристаллический полимер, структура которого стабилизирована сложной системой водородных связей
[7][11]
1. Степень кристалличности достигает максимума у полностью ацетилированного хитина и полностью деацетилированного хитозана
[9][11]
2. Хитозан может существовать в гидратированной и безводной формах
[11]
3. Равномерность распределения ацетильных групп вдоль цепи влияет на способность полимера к кристаллизации и его растворимость
[9]
Несмотря на детальное изучение влияния вышеуказанных параметров, в мировой практике сохраняется проблема отсутствия единых стандартов (ГОСТ) на методы анализа хитозана
[16][20][9]
3. Аналитические методы анализа характеристик хитозана и критерии их оценки
Для обеспечения воспроизводимости свойств изделий на основе хитозана необходим точный контроль его структурных параметров
[9][20][21][9]
Современный арсенал инструментальных подходов к анализу хитозана принято классифицировать на три основные группы: спектральные, хроматографические и химико-аналитические методы
[13][21][22]
1. Точность и воспроизводимость: соответствие результатам референсных методов (в первую очередь ЯМР-спектроскопии)
[14][15][23]
2. Чувствительность к примесям: способность метода давать достоверный результат в присутствии остаточных белков, минеральных веществ или гигроскопической влаги, которые часто встречаются в технических образцах и могут искажать спектральные или весовые показатели
[13][15]
3. Экспрессность и стоимость: возможность проведения серийных измерений в рутинной практике без использования дорогостоящих дейтерированных растворителей и сложной многоступенчатой пробоподготовки
[24]
Ввиду того, что ни один из существующих методов не является абсолютно универсальным, для обеспечения максимальной достоверности в современной аналитической химии рекомендуется использовать комплексный подход, подразумевающий верификацию параметров как минимум двумя независимыми методами
[13][21]
Степень деацетилирования является наиболее важной химической характеристикой хитозана, так как именно она определяет содержание реакционноспособных аминогрупп, обуславливающих растворимость полимера в кислых средах, его физико-химическое поведение и биологическую активность
[25][26][27][21][12][13]
ИК-спектроскопия является наиболее распространенным методом экспресс-анализа хитозана, позволяющим проводить как качественную идентификацию полимера, так и количественную оценку его степени деацетилирования
[13][14][28][29][30]
ИК-спектр пропускания образца хитозана
ИК-спектр поглощения образца хитозана
Оценка СД основана на соотношении интенсивностей полос, связанных с ацетильными и деацетильными группам
[28][31]
1. Амид I (1650–1663 см-1Missing Mark : sup) является первичным индикатором ацетилирования, соответствуя валентным колебаниям связи C=O
[32][33][14]
2. Амид II (1550–1561 см-1Missing Mark : sup) и Амид III (около 1320 см-1Missing Mark : sup): полоса Амид II часто перекрывается сигналами аминогрупп (1590 см-1Missing Mark : sup), поэтому исследователи всё чаще отдают предпочтение полосе Амид III
[28][33][34]
Точность метода критически зависит от выбора полосы сравнения:
1. Валентные колебания C-H (2870–2880 см-1Missing Mark : sup) соответствуют скелету макромолекулы и практически не зависят от влажности образца
[18]
2. Деформационные колебания CH2Missing Mark : sub (1420 см-1Missing Mark : sup): их использование в паре с Амидом III (соотношение
[14][28]
Спектр ИК-Фурье чувствителен к надмолекулярной организации полимера. Так, в высококристаллическом
[31][28][31]
Главным препятствием для достижения высокой точности является экстремальная гигроскопичность хитозана
[23][33][24]
1. Рекомендуется глубокое обезвоживание образцов (в вакууме над
[35]
2. На воспроизводимость данных влияет выбор точек для проведения базовой линии
[18][14]
Несмотря на статус «рутинного» метода, ИК-спектроскопия требует строгого контроля влажности и верификации используемых уравнений с помощью абсолютных методов (ЯМР или потенциометрия). Наиболее достоверным считается комплексный подход с использованием нескольких спектральных соотношений одновременно, основные расчётные уравнения представлены в таблице 1.
Примеры расчётных уравнений с использованием ИК-спектроскопии
[14]
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса широко рассматривается как референсный метод и часто используется как «золотой стандарт», являясь наиболее точным методом определения степени деацетилирования (СД), обеспечивающим погрешность в пределах ±1%[24][29][14][21]
Пример обработки ЯМР-спектра
Пример ЯМР-спектра хитозана, 300 МГц
ЯМР образца хитозана, 600 МГц
В отличие от относительных физико-химических подходов (таких как ИК-спектроскопия), ЯМР является абсолютным методом количественного анализа: интенсивность резонансных сигналов напрямую пропорциональна количеству ядер резонирующих атомов в образце
[21][9][23]
Анализ чаще всего проводят в растворах (жидкостный ЯМР), что требует обеспечения полной растворимости полимера.
1.
Обычно используют дейтерированную соляную (DCl) или уксусную (CD3COOD) кислоту для улучшения растворимости и подавления межцепных взаимодействий[13][14][23]
2. Для улучшения разрешения спектров, снижения вязкости растворов и разрушения макромолекулярных агрегатов съемку проводят при повышенных температурах — от 60 до 90°C
[23]
3. Одной из проблем является перекрывание сигналов аномерного протона
[24][14][21]
Количественная интерпретация спектров 1Missing Mark : sup
[21][31]
1. Ацетильные группы: синглет протонов метильной группы (-
2. Протоны глюкопиранозного кольца: группа сигналов
3. Протон
Существует несколько математических подходов к расчету СД. Наиболее распространенные формулы сравнивают интенсивность метильных протонов (
[21][14]
Примеры расчётных уравнений с использованием ЯМР
· IH1-GlnNAc Missing Mark : subявляется интегральной интенсивностью для H1Missing Mark : sub (GlnNAc);
· ICH3Missing Mark : sub является интегральной интенсивностью для – CH3Missing Mark : sub;
· IH2-H6 Missing Mark : sub— сумма интегральных интенсивностей для H2Missing Mark : sub, H3Missing Mark : sub, H4Missing Mark : sub, H5Missing Mark : sub, и H6Missing Mark : sub.
Расчёт по уравнениям не всегда возможен по причине отсутствия детектируемого пика водорода H-1GlnNAcMissing Mark : sub, этот пик был перекрыт пиком сигнала дейтерированной воды или его интенсивность крайне мала (она уменьшается из-за снижения молярного содержания N-ацетилглюкозамина в молекуле хитозана и повышения СД(%), соответственно)
[43]
Несмотря на статус эталона, широкое применение ЯМР в рутинной практике ограничено высокой стоимостью оборудования и дейтерированных реактивов, необходимостью участия высококвалифицированного персонала и длительностью подготовки проб
[14]
Метод ультрафиолетовой спектрофотометрии рассматривается как чувствительный и экономически доступный метод для количественного определения СД хитозана, особенно в тех случаях, когда количество доступного образца ограничено
[9][30][44]
Прямое измерение поглощения в области 200–210 нм часто осложняется наложением сигналов растворителя (например, уксусной кислоты) и мешающим влиянием фонового поглощения макромолекул
[9][30][9]
Метод характеризуется исключительной чувствительностью: порог обнаружения N-ацетил-D-глюкозамина составляет всего 0,0005 мг/мл в 0,01 М уксусной кислоте
[9][30][44][9]
Несмотря на высокую точность, на результаты УФ-анализа могут влиять сопутствующие компоненты. Основной проблемой является присутствие белковых примесей, которые также обладают поглощением в УФ-области
[9][9]
Спектральные характеристики хитозана в УФ-области зависят не только от его состава, но и от молекулярной массы
[30][9][30]
Рентгенофазовый анализ является фундаментальным неразрушающим методом исследования надмолекулярной организации и фазового состава хитозана, позволяющим проводить анализ его структуры на уровне надмолекулярной и кристаллической организации
[31][45][46]
На дифрактограммах хитозана обычно фиксируются два основных кристаллических рефлекса
[47][48]
1. Рефлекс 020 (10°): напрямую связан с наличием ацетилированных аминогрупп. Установлено, что по мере увеличения СД интенсивность этого пика закономерно снижается, а сам он смещается в сторону больших углов.
2. Рефлекс 110 (20°): связан с упорядоченной упаковкой цепей в кристаллической решётке. При деацетилировании этот пик может смещаться в область меньших углов.
Хитозан — это полукристаллический полимер, степень упорядоченности которого критически зависит от его химической чистоты
[9][47][11]
1. Гидратированная форма: хитозан, стабилизированный молекулами воды, которые формируют колонновидные структуры между слоями.
2. Безводная форма: хитозан, получаемый при гидротермальной обработке (выше 200°C) или длительном хранении. Переход в эту форму необратим и сопровождается потерей растворимости полимера. Также метод позволяет выявлять структурные различия, обусловленные источником сырья.
Для оценки упорядоченности часто применяют индекс кристалличности (CrI),
рассчитываемый по отношению интенсивности кристаллического пика к аморфному гало [47], [48][47][43]
Индекс кристалличности (CrI %) для рентгеновского пика хитозана 020 можно определить по уравнению
[47][48][48]
· I020Missing Mark : sub – максимальная интенсивность ниже 13°2θ;
· IamMissing Mark : sub интенсивность аморфной дифракции.
Пример дифракционного спектра приведён на рисунке 9.
Рентгенодифракционный профиль хитозана
Таким образом, рентгенофазовый анализ предоставляет уникальные данные о надмолекулярной перестройке хитозана в процессе деацетилирования. Несмотря на то, что он является косвенным методом определения СД, его способность фиксировать изменения фазового состояния и полиморфизма делает его обязательным компонентом комплексного анализа хитозана. Обобщение всех методов определения СД представлено в таблице 3.
Методы определения степени деацетилирования хитина и хитозана
| Метод анализа | Принцип измерения | Диапазон СД, % | Преимущества | Ограничения и недостатки | Тип оборудования | Сложность выполнения | Источник |
| N в твёрдом теле) | ). | 0 – 100 | Высокая точность и прецизионность; абсолютный метод (не требует калибровки); возможность изучения распределения ацетильных групп и подтверждения строения биополимера. | COOD, DCl); чувствительность к чистоте реагентов. | ЯМР-спектрометр (от 300 до 750 МГц), например, Bruker Avance, Varian Inova. | Высокая: сложная пробоподготовка, длительное приготовление растворов, требуется квалифицированная интерпретация спектров. | [24] |
| ИК-спектроскопия | и др.) на основе базовых линий. | 0 – 100 (при адекватной калибровке) | Экспрессность, информативность, низкая стоимость; возможность анализа твердых образцов (порошки, пленки); идентификация кристаллических форм (α, β). | Сильная зависимость от влажности (-OH -группы воды); субъективность выбора базовой линии; обязательная калибровка по стандартам (ЯМР); точность зависит от качества подготовки таблеток KBr. | ИК-фурье-спектрометр (например, Vertex 70, Perkin-Elmer 1725X, Mattson Genesis II). | Средняя: требует тщательной сушки образцов, прессования таблеток KBr и математической обработки спектров. | [34] |
| Потенциометрическое титрование | Кислотно-основное титрование протонированных аминогрупп (прямое или обратное) раствором щелочи (NaOH) с фиксацией точек перегиба кривой pH. | Преимущественно >50 – 60 (ограничено растворимостью) | Доступность реагентов, простота оборудования, прямое количественное определение аминогрупп; высокая воспроизводимость. | Чувствительность к ионной силе, примесям (белки, зольность) и углекислому газу; длительность растворения полимера; влияние вязкости раствора на точность. | Иономер/pH-метр (напр., И-160МИ, ЭВ-74), автоматическая или ручная бюретка, магнитная мешалка. | Средняя: трудоемкий процесс, требующий точной калибровки электродов, проведения холостых опытов и построения графиков. | [49] |
| Кондуктометрическое титрование | Измерение электропроводности раствора в процессе титрования аминогрупп щелочью для определения точек эквивалентности. | Широкий (для растворимых образцов) | Четкие точки перегиба на кривых даже при плохой видимости на pH -кривых; простота используемого оборудования. | Высокая чувствительность к присутствию посторонних электролитов (солей) и примесей в растворе. | Кондуктометр, автоматическая бюретка, магнитная мешалка. | Средняя: требует контроля ионной чистоты и аккуратности при добавлении титранта. | [50] |
| УФ-спектроскопия (в т.ч. метод первой производной) | Измерение поглощения N -ацетильных групп (хромофоров) в области ~190 – 215 нм; использование производной позволяет исключить влияние фона. | 0 – 100 | Высокая чувствительность к малым концентрациям; возможность мониторинга процессов в реальном времени; минимальное влияние примесей белков (для метода производной). | Необходимость построения калибровочных кривых; помехи от посторонних хромофоров и растворителей; чувствительность к pH среды. | УФ-ВИЗ спектрофотометр (например, Shimadzu 2100, Genesys 10 UV). | Средняя: требует точного приготовления растворов и многократных разбавлений. | [35] |
| Кислотный гидролиз с ВЭЖХ | Определение количества уксусной кислоты, выделившейся при полном термическом гидролизе образца. | 0 – 100 | Высокая воспроизводимость; применим для полностью нерастворимых форм хитина. | Длительная и жесткая пробоподготовка (гидролиз при 155 °C в ампулах); сложность хроматографического разделения. | Жидкостный хроматограф (ВЭЖХ), термостат. | Высокая: длительный термический процесс и сложная очистка проб. | [13] |
| Рентгеновская дифракция | ) и степенью деацетилирования. | 17 – 94 | Неразрушающий метод; высокая скорость анализа; не требует химических реагентов. | Сильная зависимость от предыстории обработки образца и его морфологии; требует высокой гомогенности СД. | Рентгеновский дифрактометр. | Средняя: требуется тонкое измельчение порошка и специализированное программное обеспечение. | [48] |
Молекулярная масса (ММ) является вторым по значимости параметром после СД, так как она критически определяет физико-химическое поведение, реологические свойства и биологическую активность полимера
[21]
Вискозиметрический метод является наиболее распространенным, быстрым и доступным способом оценки ММ хитозана в лабораторной и заводской практике. Метод относится к относительным и основан на измерении вязкости разбавленных растворов полимера с последующим расчетом характеристической вязкости η.
Расчет средневязкостной ММ (
[51]Ванг и соавторы [51]предложили использовать функциональные соотношения для констант k и α в зависимости от СД хитозана при растворении хитозана в водном растворе 0,2 М CH3COOH/0,1 М CH3COONa при 30°С. Авторы предложили вычислять константы для хитозана следующим образом:
В кислых растворах хитозан ведёт себя как катионный полиэлектролит, что приводит к изменению конформации цепей и влияет на результаты вискозиметрических измерений
[7][51][45][51]
Гель-проникающая хроматография — это эффективный метод, позволяющий определить не только средние значения молекулярных масс (
[16]
Разделение макромолекул в колонке, заполненной пористым гелем, происходит по их гидродинамическому объему (размеру в растворе)
[22][21]
Использование ГПХ в сочетании с детекторами по светорассеянию и вискозиметрическими детекторами позволяет преодолеть ограничения калибровки и определять точные значения ММ независимо от состава стандартов
[45]
Методы определения молекулярной массы полимеров
| Метод анализа | Определяемый параметр (ММ/Полидисперсность) | Приборное обеспечение | Используемые растворители/реагенты | Диапазон применимости (СД) | Преимущества и ограничения | Источник |
| Светорассеяние | ), размер частиц, полидисперсность | Фотомеры (Fica 50, PG-21), детекторы MALLS Dawn (Wyatt), Zetasizer Nano ZS | 0.2 M NaCl, 0.3 M AcOH / 0.2 M AcONa | Широкий диапазон СД; для разбавленных систем | Абсолютный метод; не требует калибровки; высокая чувствительность к пыли, микрогелям и агрегации | |
| Вискозиметрия | ), характеристическая вязкость | Вискозиметры Уббелоде, капиллярные (Anton Paar Lovis 2000M), ротационные (Reotest-2M, Fungilab Smart L) | Ацетатный буфер, уксусная кислота (0.1–0.5 M) с NaCl или ацетатом натрия | Широкий диапазон; вязкость растет с увеличением СД | Простейший и быстрый метод; требует знания констант K и α (уравнение Марка-Куна-Хаувинка) | [53] |
| Гель-проникающая хроматография | ), распределение ММ | Жидкостный хроматограф (напр. Agilent 1260, Sykam S2100), колонки Shodex OHpaK, рефрактометр | Уксусная кислота (50 мМ), трис-HCl буфер, ацетат аммония (pH 5.1) | Удобен для ММ < 200 кДа; СД > 70% | Единственный метод для определения ММР; точность зависит от калибровки; возможна агрегация при низком СД | [45] |
| Гель-электрофорез | Молекулярная масса (экспресс-анализ) | Система GelDoc EZ, источник напряжения | Агароза, ТАЕ-буфер, краситель Кумасси R250 | ММ от 25 до 1000 кДа | Быстрый метод; не требует дорогого оборудования; оценка композиционной неоднородности | [22] |
| Мембранная осмометрия | ), полидисперсность | Осмометр Melabs (SM2), мембраны Sartorius | 0.2 M NaCl, 25°C | Полностью деацетилированный хитозан | n | [18] |
| Ультрацентрифугирование | Молекулярная масса, степень полидисперсности, гомогенность | Аналитическая ультрацентрифуга | Растворы полисахаридов | Не указано | Позволяет судить о гомогенности по числу пиков на седиментационной кривой | [52] |
| Масс-спектрометрия | Молекулярная масса олигомеров | Масс-спектрометр с лазерной десорбцией | Матрицы (например, DHB) | От 700 до 20000 Да | Наиболее точные данные для низкомолекулярных образцов (олигомеров) | [16] |
В растворах хитозан проявляет поведение катионного полиэлектролита, что определяет его конформацию, размер частиц и зарядовые характеристики. Протонирование аминогрупп приводит к возникновению электростатического отталкивания между цепями и разворачиванию макромолекулярного клубка
[54][55][20][11]
Динамическое светорассеяние используется для определения размеров частиц и макромолекулярных клубков в растворе
[56][57]
ζ-потенциал характеризует заряд поверхности и стабильность коллоидных систем хитозана
[58][59][58][16]
Основным методом является электрофоретическое рассеяние света, основанное на доплеровском сдвиге рассеянного лазерного излучения в электрическом поле
[58]
Термогравиметрический анализ (ТГА) и дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК) позволяют оценить термическую стабильность, содержание влаги и процессы деструкции хитозана. Традиционно процесс термического разложения хитозана протекает в два основных этапа, параметры которых существенно зависят от СД и ММ полимера
[43][60]
1. Первый этап (дегидратация) наблюдается в интервале температур 50–100°C (с максимумом около 60–95°C) и проявляется в виде эндотермического пика на кривой ДСК
[61]
2. Второй этап (термическая деструкция)
[31]
Температура начала разложения хитозана напрямую коррелирует с его химическим составом. С увеличением СД (удалением ацетильных групп) начальная температура термической деградации закономерно снижается, так как деацетилированные домены менее стабильны при нагревании, чем ацетилированные фрагменты. Таким образом, термический анализ является не только методом оценки термостойкости, но и косвенным инструментом для подтверждения структурных особенностей хитозана.
4. Заключение
Проведенный анализ подтверждает, что хитозан представляет собой семейство структурно неоднородных природных полимеров, физико-химические свойства которых определяются степенью деацетилирования, молекулярной массой, конформационным состоянием и надмолекулярной организацией цепей.
Показано, что ЯМР-спектроскопия является референсным методом («золотым стандартом») определения степени деацетилирования, тогда как корректная оценка ММ требует сочетания вискозиметрии, гель-проникающей хроматографии и методов светорассеяния для учета полидисперсности и конформационных эффектов. Дополнительно установлено, что методы термического анализа, рентгенофазового анализа, а также измерения ζ-потенциала и
гидродинамических характеристик
В совокупности результаты показывают, что наиболее достоверная характеристика хитозана достигается при использовании взаимодополняющих аналитических подходов, учитывающих его полиэлектролитную природу и склонность к структурной перестройке в растворах.